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一氧化氮(Nitric oxide,NO)含量測(cè)定試劑盒說明書微量法
更新時(shí)間:2024-11-20 點(diǎn)擊量:278

一氧化氮(Nitric oxide,NO)含量測(cè)定試劑盒說明書

微量法

注意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

NO(Nitric Oxide,NO)廣泛分布于生物體內(nèi)神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖等系統(tǒng)中, 特別是神經(jīng)組織中較豐富。它作為細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)的信息物質(zhì),發(fā)揮信號(hào)傳遞的作用,是一

種新型的生物信使分子,在機(jī)體的生理、病理過程中起著重要的作用。

測(cè)定原理:

NO 在體內(nèi)或水溶液中極易氧化生成 NO2— ,在酸性條件下,NO2— 與重氮鹽磺酸胺生成重氮 化合物,進(jìn)一步與萘基乙烯基二胺偶合,產(chǎn)物在 550nm 處有特征吸收峰,測(cè)定其吸光值, 可以計(jì)算 NO 含量。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:

天平、研缽或勻漿器、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、蒸餾水。 試劑組成和配制:

提取液:液體 100mL× 1 瓶,4℃保存。

試劑一:液體 6mL× 1 瓶,4℃避光保存。(用之前震蕩溶解后使用)

試劑二:液體 6mL× 1 瓶,4℃避光保存。(用之前 60℃加熱震蕩 15min)

樣品處理:

1.    組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~ 10 的比例(建議稱取約 0. 1g 組織,

加入 1mL 提取液)進(jìn)行冰浴勻漿。10000g ,4℃離心 15min ,取上清,置冰上待測(cè)。

2.    細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):提取液體積(mL)為 500~ 1000:1 的比例(建 議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率 300w ,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時(shí)間 3min);然后 10000g ,4℃ , 離心 15min ,取上清置于冰上待測(cè)。

3.    體液和培養(yǎng)液等其它液態(tài)樣品:直接測(cè)定。

測(cè)定步驟和操作表:

1 、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 550nm。

2 、操作表


空白管

測(cè)定管

樣品(μL)


100

提取液(μL)

100


試劑一 (μL)

50

50

試劑二(μL)

50

50

混勻,室溫靜置 15min ,于微量石英比色皿/96 孔板,測(cè)定 A550 , ΔA=A 測(cè)定-A 空白

NO 含量計(jì)算:

a.   用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y= 0.016x -0.0103 ,R2= 0. 9986

1 、組織樣品:

1)按樣本質(zhì)量計(jì)算

NO 含量(μmoL/g  鮮重)=( ΔA +0.0103)÷0.016×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W) × 10-3 = 0.125×  ( ΔA +0.0103)÷W

2)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NO 含量(μmoL/mg prot)=( ΔA +0.0103)÷0.016×V 反總÷(V 樣×Cpr) × 10-3 = 0.125×  ( ΔA +0.0103)÷Cpr

2 、細(xì)胞:

NO 含量( μmol/104  cell)=( ΔA +0.0103)÷0.016×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量)× 10-3 = 0.125×  ( ΔA +0.0103)÷細(xì)胞數(shù)量(萬個(gè))

3 、其他樣品:

NO 含量(μmoL/L)=( ΔA +0.0103)÷0.016×V 反總÷V 樣

= 125×  ( ΔA +0.0103)

V 反總:反應(yīng)總體積,0.2mL;V 樣:反應(yīng)中樣品體積,0. 1mL;V 樣總:加入提取液體積,

1mL;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr:蛋白濃度,mg/mL

b.   用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y= 0.008x - 0.0103 ,R2= 0. 9986

1 、組織樣品:

1)按樣本重量計(jì)算

NO 含量(μmoL/g  鮮重)=( ΔA +0.0103)÷0.008×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W) × 10-3 = 0.25×  ( ΔA +0.0103)÷W

2)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NO 含量(μmoL/mg prot)=( ΔA +0.0103)÷0.008×V 反總÷(V 樣×Cpr) × 10-3 = 0.25×  ( ΔA +0.0103)÷ Cpr

2 、細(xì)胞:

NO 含量( μmol/104  cell)=( ΔA +0.0103)÷0.008×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量)× 10-3 = 0.25×  ( ΔA +0.0103)÷細(xì)胞數(shù)量(萬個(gè))

3 、 其他樣品:

NO 含量(μmoL/L)=( ΔA +0.0103)÷0.008× V 反總÷V 樣=250×  ( ΔA +0.0103)

V 反總:反應(yīng)總體積,0.2mL;V 樣:反應(yīng)中樣品體積,0. 1mL;V 樣總:加入提取液體積, 1mL;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr:蛋白濃度,mg/mL

 

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